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試劑與材料準備：需要準備微生物基質試劑盒（含Ａ液和Ｂ液）、接種環（１μＬ）、微量移液器和吸頭（２．５μＬ）等。
樣本要求：待檢樣本必須是經培養基分離后的純化菌落。常用的培養基包括哥倫比亞血瓊脂、沙保氏葡萄糖瓊脂培養基等。樣本應新鮮培養，以滿足鑒定準確性的要求。
樣本前處理：細菌制備采用直涂法。使用１μＬ接種環挑取合適菌落，將微生物菌落涂在靶點中央位置，并攤涂均勻，形成薄層。然后用移液器滴加２μＬ Ｂ液，待其自然干燥后，滴加１．５μＬ Ａ液于靶點正中，自然干燥，待測。操作時應戴無粉手套，避免污染。
上機檢測：將制備好的靶板放入質譜儀中進行檢測。需要注意的是，水分進入真空系統可能會損壞儀器，因此需待靶板完全干燥后，方可將靶板載入真空倉。
數據采集：在質譜儀中，樣品通過有效的電離將不同質荷比（ｍ／ｚ）的離子分開形成細菌特異性的清晰的指紋圖譜。
數據分析：通過分析關鍵的質譜峰數據，與數據庫中的已知菌種譜圖進行比對，即可快速得到細菌鑒定結果。質譜儀得到的鑒定結果在報告之前，應由微生物專業人員進行審核，審核過程中可結合樣本來源、染色結果、形態學、培養條件等特征對結果的準確性進行評判。
結果報告：報告結果通常包括分值和一致性，需要專業人員進行審核和解釋，以確保結果的可靠性。
質量控制：實驗室需按照ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ制造商的推薦和相關管理指南制定質控程序，包括儀器校準、室內質量控制和室間質量評價。
操作安全：在操作過程中，應遵循生物安全要求，特別是在處理高致病性微生物時，應采用適當的滅活方法，并在生物安全柜中操作。
特殊情況處理：對于特殊類型的菌落，如黏液型菌落或干燥型菌落，可能需要特殊的處理方法以提高鑒定效果。
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